خواص دارویی و گیاهی
A11DA01
Hydrochlorid
Thiamin, Vitamin B1 oder Aneurin ist ein wasserlösliches Vitamin aus dem B-Komplex von schwachem, aber charakteristischem Geruch und ist insbesondere für die Funktion des Nervensystems unentbehrlich. Wird das Vitamin B1 für ca. 14 Tage dem Körper nicht mehr zugeführt, sind die Reserven zu 50 % aufgebraucht. Es wird im Volksmund auch Stimmungsvitamin genannt.
Thiamin besteht aus zwei Ringsystemen, die durch eine Methylenbrücke miteinander verbunden sind: einem Pyrimidin- und einem Thiazolring.
داروی vitamin b1
Thiamin wird im Darm über den aktiven Thiamintransporter und in hohen Konzentrationen vorliegend auch durch Diffusion aufgenommen. Es existieren seltene erbliche Mangelkrankheiten dieser Proteine. Bei der Thiamin-responsiblen, megaloblastären Anämie (TRMA) kommt es durch Mutationen im SLC19A2-Gen zu Funktionsunfähigkeit des aktiven Thiamintransporters. Hierdurch kann das in der Nahrung in niedrigen Konzentrationen vorliegende Thiamin nicht mehr ausreichend aufgenommen werden. Dies führt zu dem charakteristischen Krankheitsbild der TRMA mit einem Diabetes mellitus Typ 1, Gehörlosigkeit, einer megaloblastären Anämie aller Zellreihen und zu schweren Störungen der Herzfunktion. Unbehandelt führt die TRMA zum Tode. Durch Verabreichung einer hohen Dosis von Thiamin kann ausreichend Thiamin über den Darm durch Diffusion aufgenommen werden.
Thiamin selbst wird im Körper nicht verwendet. Mithilfe des Enzyms Thiaminpyrophosphokinase wird es zunächst zu Thiaminpyrophosphat (TPP, auch Thiamindiphosphat, TDP) umgewandelt. In dieser biologisch aktiven Form ist es Coenzym der Pyruvatdehydrogenase E1, der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase, der α-Ketosäure-Dehydrogenase und der Transketolase.
Mittels Pyruvatdehydrogenase-Komplex (PDC) wird in den Mitochondrien Pyruvat zu Acetyl-CoA umgebaut. TPP dient diesem Enzymkomplex als Coenzym bei der Abspaltung von CO2[6] und macht damit die aerobe Verwertung von Glucose (und damit auch anderer Kohlenhydrate) erst möglich.[7]
Ist dieser Stoffwechselweg blockiert, wird im Cytosol aus Pyruvat durch Milchsäuregärung Lactat erzeugt, was eine vergleichsweise ineffiziente Form der Energiegewinnung darstellt.[8]
Thiamin ist hitzeempfindlich, es wird durch Kochen zerstört. Es ist wasserlöslich, dadurch geht beim Kochen in Wasser ein Teil ins Kochwasser verloren. In rohem Fisch und Farnen ist das Enzym Thiaminase enthalten, das Thiamin abbaut und somit vernichtet. Konservierungsstoffe aus der Gruppe der Sulfite (E 220 – E 228)[9] zersetzen ebenfalls Thiamin.
Bei der Herstellung von weißem Mehl (z. B. Typ 405) oder weißem Reis wird der braune Keim der Pflanze vom Rest des Samens (Endosperm) entfernt. Der Keim enthält jedoch das gesamte Vitamin B1 des Samens, welches zur Verbrennung der enthaltenen Kohlenhydrate benötigt wird.
Im Gegensatz dazu bleibt in Vollkornmehl und braunem Reis das Vitamin B1 weitestgehend enthalten.
Um den Verlust bei der Verarbeitung auszugleichen wird in vielen Ländern dem Mehl und Reis das Vitamin B1 wieder künstlich zugesetzt. Inzwischen verfahren 71 Länder bei Mehl so, darunter Großbritannien, USA und Kanada, jedoch nicht Deutschland.[10]
Pro 100 g der folgenden Lebensmittel sind laut Bundeslebensmittelschlüssel (BLS) bzw. Römpp Lexikon Chemie die angegebenen Mengen Thiamin enthalten:
In Südamerika wird häufig Thiamingabe vor Reisen in das Amazonasgebiet als Abwehr gegen Moskitos eingesetzt, da die Mücken den Geruch ablehnen würden. Die Schutzwirkung ist individuell verschieden und wird von zahlreichen Autoren angezweifelt.
Laut der Berliner Ernährungswissenschaftlerin Vera Spellerberg ist die schlechte Versorgung der Bevölkerung mit den B-Vitaminen seit Jahrzehnten bekannt. Insbesondere mangele es an B1 aber auch an B6. Vollkornprodukte würden ganz besonders diese B-Vitamine liefern.[14] Laut der Nationalen Verzehrstudie II liegt in allen Altersgruppen der Median der Vitamin B1-Zufuhr deutlich über der empfohlenen Zufuhr, jedoch erreichen 21 % der Männer und 32 % der Frauen die empfohlene tägliche Zufuhr von Vitamin B1 nicht.[15]
Bereits 1896 stellte Christiaan Eijkman nach seiner Rückkehr von seiner Asienreise nach Europa fest: “Weißer Reis kann giftig sein!” Zuvor hatte er in Java gehäuft Fälle von Beriberi beobachtet, die durch eine gründlichere Politur des weißen Reises verursacht wurde.[16]
Symptome:
Alzheimer-Patienten zeigen eine verminderte Glucose- und Sauerstoffverwertung im Gehirn, die mit einem Thiaminmangel einhergeht.[17][18] Der Mangel könnte nicht nur die Folge, sondern die Ursache der Krankheit sein.[19] Auch können erniedrigte Thiaminpyrophosphat-Werte in Blut und Gehirn als Diagnosekriterium zur Abgrenzung von Alzheimer zu anderen Formen der Demenz verwendet werden.[20]
Thiamin besitzt eine große therapeutische Breite. So zeigen tierexperimentelle Befunde bei Ratten, dass selbst eine 100fach über dem täglichen Bedarf liegende Dosis über drei Generationen ohne Nebenwirkungen vertragen wurde.
Nach Verabreichung in den Muskel bzw. in die Vene wurden allerdings in Einzelfällen teils schwerste Überempfindlichkeitsreaktionen bis hin zu Atemnot und Schockzuständen beschrieben. Wegen dieser allergischen Reaktionen sollte Vitamin B1 daher nur in Ausnahmefällen parenteral angewendet werden; orale Therapie der Wahl zur Vitamin-B1-Substitution ist die fettlösliche und dadurch hervorragend gewebegängige Thiamin-Prodrug Benfotiamin.
داروی vitamin b1
Bei Patienten, die aufgrund einer Herzinsuffizienz mit einem Diuretikum (z. B. Furosemid) behandelt werden, kann die Herzfunktion durch eine hochdosierte Vitamin-B1
-Supplementierung verbessert werden. Darauf weisen erneut die Ergebnisse einer klinischen Studie hin, die in der Schweiz durchgeführt wurde.
Mit 3 bis 8 μg/g weist der Herzmuskel den höchsten Gehalt an Thiamin (Vitamin B1)
im menschlichen Körper auf. Bei Patienten, die wegen kardiovaskulärer Erkrankungen (z. B. Herzinsuffizienz) Furosemid erhielten, konnte anhand eines signifikanten Abfalls der erythrozytären Transketolase (ETK)-Aktivität im Vollblut ein Thiaminmangel nachgewiesen werden. Andererseits verbesserte die Gabe von Thiamin (200 mg tgl., i. v.) bei Patienten, die aufgrund einer Herzinsuffizienz mit dem Diuretikum Furosemid behandelt wurden, nicht nur die laborchemischen Marker eines Thiaminmangels, sondern auch die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) des Herzmuskels.
Thiamin hat eine zentrale Bedeutung für die energetische Verwertung von Kohlenhydraten im Rahmen des mitochondrialen Energiestoffwechsels. Allerdings besteht unter den B-Vitaminen vor allem für Thiamin aufgrund seiner geringen Speicherkapazität (25 – 30 mg) und hohen Umsatzrate das Risiko, in einen kritischen Bereich abzusinken. Ein latenter Thiaminmangel ist dementsprechend weit verbreitet [1].
Bis zu 50% der älteren Menschen in Industrienationen werden langfristig mit einem Diuretikum behandelt. Schon seit Langem ist bekannt, dass diese Diuretika-Therapie mit einem erhöhten Risiko für einen Thiaminmangel verbunden ist. Denn durch die erhöhte Harnausscheidung wird auch das wasserlösliche Vitamin vermehrt über den Urin ausgeschieden. Einer früheren Studie zufolge sind 33% aller Patienten mit Herzinsuffizienz von einem Thiaminmangel betroffen. Der Diuretika-induzierte Thiaminmangel kann eine Herzinsuffizienz verschlimmern (kardiale oder “nasse” Beriberi).
Mechanismus: Furosemid und andere Diuretika erhöhen signifikant die renale Thiaminausscheidung, denn aufgrund seiner niedrigen Molekularmasse ist die tubuläre Rückresorption des Thiamins gering. Die Kardiomyozyten nehmen entsprechend weniger Thiamin auf.داروی vitamin b1
Folgen des Thiaminmangels: Abfall der ETK-Aktivität, Verschlechterung der Herzmuskelfunktion (Herzinsuffizienz, Kardiomyopathie), Begünstigung einer Lactatazidose.
Hinweis: Zur Unterstützung der Herzfunktion und Kompensation medikationsbedingter Verluste unter einer Therapie mit Diuretika sollten die Patienten neben Magnesium einen Vitamin-B-Komplex mit den Vitaminen B1, B6, B12
und Folsäure einnehmen (Folsäure vor allem bei Hydrochlorothiazid-Triamteren-Kombinationen!).
Zur oralen Kompensation eines Vitamin-B1
-Defizits eignet sich vor allem das lipidlösliche Thiamin-Prodrug Benfotiamin.
Ein subklinischer Thiaminmangel ist ein unterschätztes Problem bei Patienten mit Herzinsuffizienz und Diabetes mellitus. Ein Thiaminmangel kann zu den als Beriberi bekannten Syndromen führen und sowohl Nervenstörungen (“trockene” Beriberi) als auch eine Herzinsuffizienz (“nasse” Beriberi) verursachen oder verschlimmern. Unter Umständen kann die Therapie der Herzinsuffizienz mit einem Diuretikum deshalb sogar das Therapieziel – die Stärkung des Herz-Kreislauf-Systems – konterkarieren.
Gefährdet sind vor allem Diabetiker, die häufig mit einem Diuretikum oder mit Kombinationspräparaten zur Blutdrucksenkung behandelt werden. Denn auch der Diabetes kann mit hohen renalen Thiaminverlusten und erniedrigten Thiaminspiegeln verbunden sein. Der Mangel belastet nicht nur das Herz-Kreislauf-System, sondern fördert auch eine diabetische Neuropathie, von der etwa jeder dritte Diabetiker betroffen ist. Das Risiko, eine Herzinsuffizienz zu entwickeln, ist bei Diabetikern mehr als doppelt so hoch wie bei Stoffwechselgesunden [2].
In älteren Studien an Patienten, die aufgrund einer Herzinsuffizienz mit Furosemid behandelt wurden, verbesserten Thiamingaben (200 mg tgl., i. v.) nicht nur die ETK-Aktivität, sondern auch die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) des Herzmuskels. Dass Herzkranke unter Diuretikatherapie von einer hochdosierten Thiamingabe profitieren, bestätigen jetzt erneut die Ergebnisse einer Studie von Andreas Schoenenberger, Bern, und Mitarbeitern [3]. Neun Patienten, die aufgrund einer chronischen Herzinsuffizienz (LVEF von weniger als 40%) mit einem Diuretikum behandelt wurden, erhielten zusätzlich entweder 300 mg Thiamin pro Tag oder ein Placebo. Nach 28 Tagen verbesserte sich in der Verumgruppe die LVEF signifikant gegenüber der Placebogruppe. Der absolute Therapieeffekt betrug 3,9%.
Quellen
Omeprazol beeinträchtigt die Vitamin B12-Resorption, Statine interferieren mit dem Coenzym-Q10-Status, Thiazid-Diuretika steigern den renalen Verlust an Magnesium und erhöhen dardurch das Risiko für Stoffwechselstörungen. Dies sind nur einige Beispiele, wie sich Nahrungsmittel, Mikronährstoffe und Arzneistoffe gegenseitig beeinflussen.
Die 2. Auflage dieses Buches wurde komplett überarbeitet und erweitert. Neu sind die Kapitel Antidementiva, Antidepressiva, Psychostimulanzien und Mitochondriale Toxizität von Arzneimitteln.
Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Mikronährstoffen sind ein wichtiges Beratungsthema. Nutzen Sie für Ihre Patienten Mikronährstoffe nach dem Motto: Therapie optimieren, Nebenwirkungen reduzieren!
Uwe Gröber
2., neu bearbeitete und erweiterte Auflage.
440 S., 70 farb. Abb., 76 Tab. Geb. 49,– Euro
Subskriptionspreis bis 31. März 2012: 39,50 Euro
Dieses Buch können Sie einfach und schnell bestellen unter der Postadresse:
Deutscher Apotheker Verlag, Postfach 10 10 61, 70009 Stuttgart
oder im Internet unter: www.buchoffizin.de
oder per Telefon unter: (07 11) 25 82 – 3 41
oder- 3 42
DAZ 2012, Nr. 8, S. 86
DAZ 2012,
Nr. 8, S. 86, 23.02.2012
Meist gelesen
Meist kommentiert
zur Verbesserung der medizinischen Versorgung in Deutschland
Zertifizierte Fortbildung
Lernen und Punkten »
Klinische Pharmazie – POP »
Rechtliches
داروی vitamin b1
Service
Verlag
DEUTSCHE APOTHEKER ZEITUNG
Die Deutsche Apotheker Zeitung (DAZ) ist die
unabhängige pharmazeutische Fachzeitschrift für Wissenschaft und Praxis.
Sie erscheint wöchentlich jeweils donnerstags. Sie wendet sich an alle
Apothekerinnen, Apotheker und andere pharmazeutische Berufsgruppen.
DAZ.online ist der unabhängige tagesaktuelle Newsbereich für alle
Apotheker und pharmazeutischen Berufsgruppen sowie an Gesundheitspolitik und evidenzbasierter
Pharmazie interessierte Leser. Schwerpunkt des Redaktionsprogramms ist die Vermittlung aller
Informationen und Nachrichten aus den Bereichen Wissenschaft,
Arzneimitteltherapie, Praxis, Berufs- und Gesundheitspolitik sowie Recht, die für pharmazeutische Berufe von Interesse sind. Dazu
gehören insbesondere aktuelle Mitteilungen und Informationen über Arzneimittel,
Übersichtsarbeiten von anerkannten Fachautoren aus Wissenschaft und
Praxis, Tagungs- und Kongressberichte, Neuigkeiten über Arzneimittel und
Arzneimitteltherapien, Kommentare und Meinungen.
2019 Deutsche Apotheker Zeitung
Diese Webseite verwendet Cookies, um Ihnen einen nutzerfreundlichen Service zu bieten sowie Nutzerverhalten in pseudonymer Form zu analysieren. Indem Sie fortfahren, unsere Seite zu nutzen, akzeptieren Sie die Verwendung von Cookies und stimmen den Analysemaßnahmen zu. Weitere Informationen sowie die Möglichkeit zum Widerruf finden Sie in unserer Datenschutzerklärung
mehr Themen
11.12.2013 – 08:00
Gesellschaft für Biofaktoren e.V.
Stuttgart (ots)
Wenn übermäßiger Alkoholkonsum das Nervensystem angreift, ist oftmals ein Mangel an Vitamin B1 mit im Spiel: 30 bis 80 % der Alkoholabhängigen sind unzureichend mit dem lebenswichtigen Vitamin versorgt. Das Defizit an dem Nährstoff fördert aber nicht nur alkoholbedingte Nerven- und Hirnschäden, sondern kann offensichtlich auch das unkontrollierte Trinkverhalten verstärken. US-Wissenschaftler um Ann M. Manzardo von der Universität Kansas wiesen jetzt in einer placebokontrollierten Studie mit Alkoholabhängigen nach, dass eine orale Behandlung mit der Vitamin-B1-Vorstufe Benfotiamin den Alkoholkonsum bei Frauen deutlich reduzieren kann (Drug Alkohol Depend. 2013 Dec 1;133(2):562-70). داروی vitamin b1
Schon frühere tierexperimentelle Studien haben gezeigt, dass ein Vitamin B1-Mangel ein krankhaftes Trinkverhalten fördert. Offensichtlich verursacht der Nährstoffmangel Schäden im zentralen Nervensystem, die wiederum die Verhaltenskontrolle beeinträchtigen. Daher vermuteten die Wissenschaftler aus Kansas, dass eine hoch dosierte Vitamin-Therapie die gestörten Funktionen regenerieren und so die Kontrolle über das Trinkverhalten positiv beeinflussen kann.
Ann M. Manzardo und ihre Mitarbeiter behandelten 120 aktiv trinkende alkoholabhängige Männer und Frauen 24 Wochen lang entweder mit 600 mg Benfotiamin pro Tag oder mit einem Scheinmedikament (Placebo). Benfotiamin ist eine Vorstufe vom Vitamin B1, die im Darm in wesentlich höheren Konzentrationen ins Blut geschleust wird als herkömmliches Vitamin B1 (Thiamin). Im Körper wird das Provitamin dann in Vitamin B1 umgewandelt. “Diese pharmakologischen Eigenschaften des Benfotiamins erlauben einen schnellen Ausgleich eines Thiamin-Mangels”, erklären die Autoren. Die Forscher beobachteten, dass bei den mit Benfotiamin behandelten Frauen der Alkoholabusus deutlich abnahm, bei den Männern zeigte sich dieser Effekt allerdings nicht. Der durchschnittliche tägliche Alkoholkonsum der Frauen verringerte sich nach drei monatiger Therapie mit dem Provitamin um 60 %, in der Placebogruppe hingegen nur um 13 %. Dabei wurde die Vitamin-Therapie sehr gut vertragen.
Warum das weibliche Geschlecht stärker auf die Behandlung anspricht als das männliche, erklären die Forscher anhand früherer Untersuchungen. Hier habe sich gezeigt, dass alkoholkranke Frauen empfindlicher auf einen Thiamin-Mangel reagieren und schneller neurokognitive und neuropsychiatrische Folgeerscheinungen entwickeln als Männer.
In verschiedenen klinischen Studien wurde bereits nachgewiesen, dass Benfotiamin die Symptome alkoholisch bedingter Nervenschäden, der alkoholischen Neuropathie, deutlich reduzieren kann. Aber auch bei diabetesbedingten Nervenschäden (diabetische Neuropathie) wird das Provitamin erfolgreich angewendet.
“Die schwerwiegenden Folgen eines durch Alkohol verursachten Vitamin B1-Mangels werden häufig unterschätzt und sollten stärkere Beachtung finden”, kommentierte die Gesellschaft für Biofaktoren e.V. die Studienergebnisse. Denn: “Der rechtzeitige Ausgleich des Vitamin-Defizits kann für die Prognose der Patienten von großer Bedeutung sein und irreversiblen Nerven- und Hirnschäden entgegenwirken”, erklärte der Dresdner Pharmakologe Prof. Joachim Schmidt von der GfB.
In Deutschland haben rund 21 % der Menschen einen problematischen Alkoholkonsum und 3 – 4 % sind alkoholabhängig.
Weitere Informationen: www.gf-biofaktoren.de
Pressekontakt:
Kerstin Imbery-Will
Büro für Öffentlichkeitsarbeit
Tel/Fax.: 04183/774623
E-Mail: imbery-will@t-online.de
Original-Content von: Gesellschaft für Biofaktoren e.V., übermittelt durch news aktuell
Stuttgart (ots) – Bluthochdruck, Diabetes, Fettstoffwechselstörungen: Mit zunehmenden Alter steigt das Risiko, von mehreren herz- und gefäßbelastenden Gesundheitsstörungen gleichzeitig betroffen zu sein. Meist wird nicht bedacht, dass sowohl die Erkrankungen als auch die dagegen verordneten Arzneimittel …
Stuttgart (ots) – Eine Vorstufe vom Vitamin B1, das Benfotiamin, schirmt offensichtlich kurzfristig die Blutgefäße von Rauchern vor den schädlichen Einflüssen des Zigarettenkonsums ab. Das wiesen Wissenschaftler um Dr. Alin Stirban vom Herz- und Diabeteszentrum NRW, Bad Oeynhausen, in einer aktuellen klinischen Studie nach. Für die Wissenschaftler liefern die Erkenntnisse wertvolle Informationen über den bisher vor …
Stuttgart (ots) – Zahlreiche Arzneimittel können einen Magnesium-Mangel verursachen. Die Folgen sollten nicht unterschätzt werden, wie Wissenschaftler der Gesellschaft für Biofaktoren e.V. (GfB) in einer aktuellen Fach-Publikation verdeutlichen. Ein Defizit an dem lebenswichtigen Mineralstoff kann nicht nur dem …
Social Media:
Your gateway to improving performance
Celebrating 25 years of impurity standards
Our smarter solutions make a world of difference
Supporting your analysis for over 40 years
داروی vitamin b1
World leader for chemical and bio-measurement
MM0049.00
67-03-8
C12 H17 N4 O S . Cl . Cl H
337.27
API
500 mg
Estimated dispatch
Auf Lager und versandbereit
In stock – ready for immediate dispatch.
Sie suchen eine andere Lot?
Geben Sie Ihre E-Mail-Adresse ein und wir senden Ihnen eine E-Mail mit den relvanten AZ für Lot: {{value}}
Wir senden Ihnen das Analysenzertifikat innerhalb von 2 Arbeitstagen an Ihre Email-Adresse {{CoaForm.email}}
Hier finden Sie ein Sicherheitsdatenblatt für Ihre Region
67-03-8
C12 H17 N4 O S . Cl . Cl H
337.27
336.0578
Cl.[Cl-].Cc1ncc(C[n+]2csc(CCO)c2C)c(N)n1
InChI=1S/C12H17N4OS.2ClH/c1-8-11(3-4-17)18-7-16(8)6-10-5-14-9(2)15-12(10)13
2-[3-[(4-amino-2-methylpyrimidin-5-yl)methyl]-4-methyl-1,3-thiazol-3-ium-5-yl]ethanol;chloride;hydrochloride
+5°C
Room Temperature
GERMANY
29362200
API
–
–
Ihre Punchout-Sitzung läuft ab in 1 Min. 59 Sek.
Wählen Sie „Sitzung fortführen“, um Ihre Sitzung zu verlängern
Mit diesem RECIPE-Testkit wird Vitamin B1 als TPP ermittelt. Der Kit lässt sich bequem mit den Testkits für Vitamin B2 und B6 kombinieren (siehe Kombi-Kit).
Laden Sie Produktbroschüren, Produktdokumente (z.B. Sicherheitsdatenblätter) und Gebrauchsanweisungen herunter.داروی vitamin b1
RECIPE gehört zu den weltweit führenden Unternehmen für die Spezialdiagnostik mit HPLC- und LC-MS/MS Systemen. Zertifiziert nach ISO 13485.
JavaScript scheint in Ihrem Browser deaktiviert zu sein.
Sie müssen JavaScript in Ihrem Browser aktivieren, um alle Funktionen in diesem Shop nutzen zu können.
Keine NachsäulenderivatisierungEinfache HandhabungStabile Standards und Kontrollen
Vitamin B1 (Thiamin) spielt eine wichtige Rolle bei der Energiegewinnung aus Kohlenhydraten und Fetten. Die aktive Form ist das Thiaminpyrophosphat (TPP), ein Coenzym für einige enzymatische Reaktionen des Kohlenhydratstoffwechsels sowie für die Pyruvat-Decarboxylase. TPP ist außerdem beim oxidativen Glucoseabbau maßgeblich beteiligt. Die Bestimmung der Konzentration von TPP ist aussagekräftiger als Messungen des Gesamtthiamins, da so ausschließlich die physiologisch wirksame Form berücksichtigt wird.
Der Thiamin-Bedarf ist aufgrund seiner zentralen Bedeutung beim Energiestoffwechsel eng mit der Kalorienzufuhr verknüpft: je mehr Energie beispielsweise beim Leistungssport gebraucht wird, desto mehr Thiamin muss die Nahrung enthalten. Es verhindert auch eine Anhäufung von giftigen Nebenprodukten, die stoffwechselbedingt in Zellen entstehen und Herz oder Nervensystem schädigen könnten.داروی vitamin b1
Mit diesem Chromsystems-Kit wird TPP schnell und einfach direkt aus dem Vollblut bestimmt. Der Kit ist für isokratische HPLC-Systeme mit Fluoreszenz-Detektor optimiert. Die für die Floureszenzdetektion notwendige Derivatisierung erfolgt während der Probenvorbereitung – eine geräteaufwändige Nachsäulen-Derivatisierung für die Fluoreszenzdetektion entfällt. Eine spezielle HPLC-Säule und eine optimierte mobile Phase erlauben eine sichere und zuverlässige Quantifizierung in weniger als 6 Minuten.
VK = 2,8-4,9 %
VK = 4,3-4,7 %
Blutabnahme morgens vor dem Frühstück und vor einer eventuellen Medikamenteneinnahme. Die Patientenproben sind lichtgeschützt und in einem geschlossenen Gefäß bei +2 bis +8 °C 24 Stunden haltbar. Bei längerer Lagerung (bis zu 6 Monaten) sollten die Patientenproben tiefgefroren unter -18 °C aufbewahrt werden.
200 μl Vollblut/Kalibrator/Kontrolle + 100 μl Extraction Buffer in einem Reaktionsgefäß zusammengeben.
2 s schütteln (Vortex).
300 μl Precipitation Reagent zusetzen, 30 s schütteln (Vortex).
5 min bei 9000 x g zentrifugieren.
200 μl Derivatisierungslösung in einem separaten Reaktionsgefäß vorlegen.
100 μl des Überstands zugeben und gut durchmischen.
100 μl Neutralisation Buffer zugeben.
100 μl Stabilisation Buffer zugeben und mischen.
Nach frühestens 20 min 50 μl in das HPLC-System injizieren.
EX 367 nm
EM 435 nm
Einzeln lieferbare Komponenten
Best.-Nr.: 35021
Details
Best.-Nr.: 35022
Details
Best.-Nr.: 37003
Details
Best.-Nr.: 37004
Details
Best.-Nr.: 35005
Details
Best.-Nr.: 35006
Details
Best.-Nr.: 35007
Details
Best.-Nr.: 35009
Details
Best.-Nr.: 33005
داروی vitamin b1
Details
Best.-Nr.: 37008
Details
Best.-Nr.: 15010
Details
Best.-Nr.: 35110
Details
Best.-Nr.: 15009
Details
Best.-Nr.: 18035
Details
Best.-Nr.: 18001
Details
Einzeln lieferbare Kalibratoren
Best.-Nr.: 37008
Details
Einzeln lieferbare Kontrollen
Details
Als Kunde können Sie sich für den kompletten Zugang bitte hier anmelden oder neu registrieren.
Ihre Einwilligung in den Versand des Newsletters ist jederzeit widerruflich per E-Mail an marketing@chromsystems.de, an die im Impressum angegeben Kontaktdaten oder über den Abmeldelink im jeweiligen Newsletter. Der Newsletter-Versand erfolgt entsprechend unserer Datenschutzerklärung.
JavaScript scheint in Ihrem Browser deaktiviert zu sein.
Sie müssen JavaScript in Ihrem Browser aktivieren, um alle Funktionen in diesem Shop nutzen zu können.
Vitamin B1 (Thiamin) ist ein wasserlösliches Coenzym und übernimmt im Körper wichtige Steuerfunktionen, um Kohlenhydrate, Fette und Alkohol in Energie umzuwandeln. Die physiologisch aktive Form ist das Thiamindiphosphat, auch als Thiaminpyrophosphat (TPP) bezeichnet. Die Analytik von TPP sollte jener des Gesamt-Thiamins bevorzugt werden.
Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxamin sowie deren Phosphatderivate werden als Vitamin B6 zusammengefasst. Pyridoxal-5’-Phosphat (PLP) ist die aktive Coenzymform von B6 und ist an nahezu 100 enzymatischen Reaktionen beteiligt.
داروی vitamin b1
Chromsystems bietet CE-IVD validierte, komplette Kits sowie Kalibratoren und Kontrollen zur Bestimmung von Vitamin B1 und B6 an:
Ihre Anfrage ist uns wichtig. Damit wir Sie persönlich und korrekt ansprechen können, freuen wir uns über die Angabe Ihres Namens, Ihrer Firma und Ihres Landes.
* Pflichtfelder
** Durch das Absenden des Formulars erkläre ich mich damit einverstanden Informationen und Produktneuigkeiten von Chromsystems per E-Mail zu erhalten. Ihre Einwilligung in den Versand des Newsletters ist jederzeit widerruflich per E-Mail an marketing(at)chromsystems.de, an die im Impressum angegeben Kontaktdaten oder über den Abmeldelink im jeweiligen Newsletter. Der Newsletter-Versand erfolgt entsprechend unserer Datenschutzerklärung.
16 Artikel
Best.-Nr.: 35000
100 Tests
Keine NachsäulenderivatisierungEinfache HandhabungStabile Standards und Kontrollen
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 31000/WB
100 Tests
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 31000/S
100 Tests
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 52052
داروی vitamin b1
100 Tests
Spezifischer interner Standard für jeden ParameterKeine Nachsäulen-Derivatisierung Eine Probenvorbereitung und ein Lauf für beide Parameter
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 52052/Premix
100 Tests
Spezifischer interner Standard für jeden ParameterKeine Nachsäulen-DerivatisierungEine Probenvorbereitung und ein Lauf für beide ParameterVereinfachte Probenvorbereitung mit Pre-mixed Tubes
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 52952/UHPLC
1000 Tests
Trennung in weniger als 3 minSpezifischer interner Standard für jeden Parameter
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 52752/F
960 Tests
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 52952/UHPLC/F
960 Tests
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 52003
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 37008
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 31003
Vitamin B6 im Vollblut – HPLC
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 36005
Vitamin B6 im Serum/Plasma – HPLC/UHPLC
Mehr erfahren
In den Warenkorb
Best.-Nr.: 0164/0165/0167
Mehr erfahren
Details
Best.-Nr.: 0033/0034/0035
Mehr erfahren
Details
Best.-Nr.: 0031/0038/0039
Mehr erfahren
Details
Best.-Nr.: 0022/0023/0024
Mehr erfahren
Details
16 Artikel
Filter
Ihre Einwilligung in den Versand des Newsletters ist jederzeit widerruflich per E-Mail an marketing@chromsystems.de, an die im Impressum angegeben Kontaktdaten oder über den Abmeldelink im jeweiligen Newsletter. Der Newsletter-Versand erfolgt entsprechend unserer Datenschutzerklärung.
Thank you for visiting nature.com. You are using a browser version with
limited support for CSS. To obtain the best experience, we recommend you use a more up to date browser (or turn off
compatibility mode in Internet Explorer). In the meantime, to ensure continued support, we are displaying the site
without styles and JavaScript.
A Nature Research Journal
Article
|
Open Access
|
Published: 10 March 2016
Scientific Reports volume 6, Article number: 22871 (2016) | Download Citation
Infections caused by the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are today known to be a substantial threat for global health. Emerging multi-drug resistant bacteria have created a substantial need to identify and discover new drug targets and to develop novel strategies to treat bacterial infections. A promising and so far untapped antibiotic target is the biosynthesis of vitamin B1 (thiamin). Thiamin in its activated form, thiamin pyrophosphate, is an essential co-factor for all organisms. Therefore, thiamin analogous compounds, when introduced into the vitamin B1 biosynthetic pathway and further converted into non-functional co-factors by the bacterium can function as pro-drugs which thus block various co-factor dependent pathways. We characterized one of the key enzymes within the S. aureus vitamin B1 biosynthetic pathway, 5-(hydroxyethyl)-4-methylthiazole kinase (SaThiM; EC 2.7.1.50), a potential target for pro-drug compounds and analyzed the native structure of SaThiM and complexes with the natural substrate 5-(hydroxyethyl)-4-methylthiazole (THZ) and two selected substrate analogues.داروی vitamin b1
The ability of bacteria to adapt to antibiotic exposure led to the continuous development and spread of multi-drug resistant microbes causing severe infections and even death1. One of these pathogens is Staphylococcus aureus (Sa), which is currently resistant against a broad range of the most useful antibiotics2,3. Despite the emergence of antibiotic resistance and relatively high mortality rates, the development of anti-infectives has seemingly been ignored for decades as a focus of drug discovery research investigations4,5,6. Most classical antibiotics inhibit cell wall linkage, interfere with the protein biosynthesis or decline nucleic acid synthesis. Sa developed strategies to obviate these impaired processes7. According to the WHO the 21st century could become the post-antibiotic era and the World Health Assembly commissioned a global action plan in May 20148. These and other worldwide governmental activities clearly highlight the urgent need for incentives to develop agents that can overcome acquired resistance to treat bacterial and in particular staphylococcal infections.
Ideally, new antibacterial drugs should specifically target metabolic processes that are exclusive to bacteria (like the vitamin B1 biosynthetic pathway, which is conserved among most bacteria, plants and lower eukaryotes9) but absent in humans. Humans have to rely on dietary uptake of thiamin and thus side effects of potential new antibiotics targeting this vitamin metabolism are in principle avoided10. Thiamin pyrophosphate (TPP), the active form of thiamin, is essential for the metabolism of carbohydrates and the amino acid metabolism11. In Sa six enzymes, ThiM, ThiD, ThiE, a nonspecific GTPase, TenA and TPK12, are involved in the pathway (see Supplementary Fig. S1) forming TPP. Only the 3D structure of TenA (PDB code: 4FN6) is known so far13, consequently more detailed structural information about the Sa thiamin biosynthesizing enzymes is required to support structure based drug discovery investigations.
Limiting the availability of this essential co-factor will thus effectively inactivate a diverse spectrum of bacterial targets and will cause a self-multiplying downstream effect. Hence targeting this metabolism is similar in concept to developing a suicide drug14. This approach uses a special mechanism closely related to the pro-drug concept but with an unique extension: it uncouples the drug’s sites of infiltration and action. As a result thiamin dependent pathways will be affected by the metabolized products and selective pressure will be moved from a single drug target towards several pathways depending on the activated form of thiamin.
Here we report a detailed structure-function analysis of the kinase ThiM, which phosphorylates THZ in one of the first steps in vitamin B1 biosynthetic pathway. In an attempt to achieve a maximum in accuracy and reliability of the structure, micro crystals grown under microgravity conditions onboard Chinese space mission Shenzhou-815 were used to prepare seed stock solutions to grow crystals suitable for X-ray diffraction. In addition to the native structure, complexes with THZ and two selected lead compounds were analyzed.
The goal of these investigations was to identify potential pro-drug THZ analogues that do not inhibit ThiM, but will be accepted as substrates, yielding non-functional TPP analogues. In consequence these products cannot act as co-factors and the pathogen’s metabolic homeostasis will be disrupted, leading to energy imbalance, growth stoppage and, ultimately, death. As the sulfur atom in the thiazolium ring of thiamin is indispensable for the stabilization of a reactive carbanion at C2 position, forming an ylid-group, two THZ analogues with pyrazole and imidazole structure and lacking sulfur in the heterocycle were selected for comparative complex structure analyses and, in support of these studies, in vitro analyses of biochemical function were performed for them as well. It had already been shown that thiamin derivatives having an oxazolium or imidazolium ring are less reactive than thiazolium analogues, since in absence of 3d orbitals the transition state cannot be stabilized16,17,18. These comparative structural analyses of active site regions in combination with the data obtained from enzymatic assays yielded essential information to further design and optimize potential pro-drug THZ analogues.
The quaternary structure of SaThiM is a triangular homo-trimer with dimensions of approximately 72 Å on a side and 47 Å thick with three independent active sites, each located within interface regions between two monomers (see Figs 1 and 2). The structure of native SaThiM was solved and refined to 2.1 Å resolution with R and Rfree values of 20.34% and 23.04% respectively. Data collection and refinement parameters are summarized in Table 1 and the coordinates and data are available in PDB 5CM5. The homologue structure of Bacillus subtilis ThiK (PDB code: 1C3Q19), sharing 38% sequence identity, was used as a search model for molecular replacement phasing.
Cartoon representation of the SaThiM monomer. Helices are coloured in cyan and ß-sheets in magenta. The active site region with a bound THZ and a magnesium ion are highlighted and colored in green.
(a) Cartoon representation of the SaThiM trimer, each monomer colored differently. The three active sites are located within the interface regions of the monomers, bound THZ molecules are shown as red spheres. (b) Front view of the SaThiM trimer ab initio shape in turquoise obtained from SAXS measurements and superimposed on the crystal structure, shown in a purple ribbon representation. (c) Detailed view to the interface and active site region with functional residues shown in stick representation with carbon chain atoms in the respective chain color, nitrogen in blue and oxygen in red. THZ is also shown in stick representation with carbon atoms in grey, nitrogen in blue and oxygen in red.
The secondary structure of SaThiM consists of approximately 50% α-helical and approximately 18% β-sheet structural elements (see Fig. 1). The core of each monomer contains nine β-sheets that are flanked by five α-helices and six α-helices. The first six β-sheets are parallel to each other with a corresponding strand order 2-1-3-4-5-6. The following β-sheet strand 7 is antiparallel to strand 6 and following β-sheet strand 8, which is antiparallelly flanked by β-sheet strand 9. This fold of the phosphotransferase ThiM is homologous to that common to the group of ribokinase-like folded kinases20. For all six molecules in the asymmetric unit no electron density was observed for the last two residues of the C-terminus and for the loop region between residues 126 and 140. Therefore these residues were not modeled. Analysing the interface regions of protomers A, B and C revealed that 10 intermolecular H-bonds support the complex formation. Analysis was done by manual inspection using the program PDBsum21. All intermolecular interactions are summarized in Supplementary Tables S1 and S2. The total surface of one monomer was calculated to be approximately 11,500 Å2 with almost 1,000 Å2 buried upon assembly of two monomers. The ThiM trimer has approximately 27,000 Å2 solvent accessible surface area, and approximately 5,700 Å2 of the monomeric surface accessible area is buried upon quarternary structure formation (see Fig. 2).
The trimeric assembly observed in the crystal structure was validated in solution with small angle X-ray scattering (SAXS). The experimental radius of gyration Rg of 30 ± 2 Å, the maximum dimension Dmax of 90 ± 10 Å and the shape of the p(r) function (Supplementary Fig. S2), point to a globular structure. The protein molecular mass estimated from the Porod volume and from the ab initio model built with the program DAMMIF22 are 91 ± 8 kDa and 77 ± 8 kDa respectively, which is compatible with trimeric SaThiM in solution. The DAMMIF model with enforced P3 symmetry is well superimposable with the crystal structure and resembles the trimeric structure in solution, as shown in Fig. 2b. The scattering computed from the trimeric model where the missing residues were symmetrically reconstructed with the program CORAL23 fits the experimental SAXS data well with χ2 = 0.6 (see Supplementary Fig. S2). All SAXS-derived parameters are summarized in Table 2, the scattering data and the models are deposited in SASBDB22, code: SASDAX8.
A sequence alignment of ThiM with homologous structures by means of a NCBI/Blast PDB search option showed only a moderate degree of structural conservation among ThiM-type enzymes in bacteria (see Supplementary Fig. S3). SaThiM shares 32% amino acid sequence identity with E. faecalis ThiM (PDB code: 3DZV), 38% with B. subtilis ThiK (PDB code: 1C3Q) and 39% identity with P. horikoshii ThiM (PDB code: 3HPD). The corresponding Cα r.m.s.d. values are 1.6, 1.3, and 1.2 Å and maximum displacements were calculated to be 4.6, 4.5 and 4.2 Å, using the protein structure comparison service Fold at the European Bioinformatics Institute24. The overall fold of the structures is conserved, whereas higher differences were found in the loop regions from residues 126–140 (connecting helix 6 and 7), 199–210 (connecting helix 8 and 9), 227–231 (connecting helix 9 and 10) and the regions close to N- and C-termini (see Figs 1 and 3). In Sa, part of the interface stabilization is conserved and mediated through inter-protomer H-bonds: E45 forming three H-bonds to R98, and S95 and D243 forming three H-bonds to P234 and T236 in the neighboring monomer (see Fig. 2c). A comparison of homologous hydroxyethylthiazole kinases from B. subtilis and P. horikoshii shows that this pattern of stabilization in the interface regions of the trimeric assembly, with two defined positions with amino acids forming two H-bonds to two neighboring amino acids, is highly conserved.
Stereo view of the superimposed homologues structures of SaThiM (colored in green) and ThiK from Bacillus subtilis (colored in blue) in a cartoon representation. The regions with higher differences, the loop region from residues 199–210 connecting helix 8 and 9 and close to N- and C-termini, are colored in red. The loop regions 126–140 are not modeled into SaThiM structure.
Based on the crystal structure in complex with the natural substrate THZ, refined to 1.90 Å resolution with R and Rfree values of 18.61% and 20.95% respectively (Table 1, PDB: 5COJ), the three identical active sites of the trimer were characterized and the mode of action for phosphorylation could be proposed. In the crystal structure, THZ identically occupies all six active sites of the two trimers in the asymmetric unit. A view of the experimental electron density of ThiM in complex with THZ can be found as Supplementary Fig. S4. THZ binding is mediated by interactions with amino acids N19, V21, G61, V90, T186, G187 and C190 of one monomer and P37, A38 and M39 of the corresponding neighboring monomer, all located in the interface region. Substrate binding is mainly stabilized by H-bonds formed by the nitrogen of the heterocycle and via the flexible hydroxyl group of THZ (see Fig. 4a). The orientation of the hydroxyl group, as extracted from the THZ complex formation in all six active sites in the asymetric unit, can adopt slightly different orientations (see Supplementary Table S3). In summary THZ forms six direct H-bonds to residues M39, P37, G61, T186 and C190. For the ThiM-THZ complex four Mg2+ ions, essential for the phosphor transfer reaction, were located within four active sites of the two trimers in the asymmetric unit. The Mg2+ ions are coordinated by residues D88, K115 and E120 and one solvent water molecule as shown in Fig. 4a. No Mg2+ ion was found in the native structure. Utilizing also the structural data obtained from homologous ThiM-complex structures, such as the mutated ThiK homologue, from Bacillus subtilis19 (PDB code: 1ESQ) with bound ATP and THZ, as well data known about conserved phosphoryl transfer within ribokinases-like kinases25, the following mode of action can be proposed, which is additionally illustrated in Supplementary Fig. S5. Enhanced nucleophilicity of the THZ alcohol is expected due to a proton-relay system consisting of a water molecule, which is coordinated by a magnesium ion and C190. Additionally two oxygen atoms of the ATP-γ-phosphate are coordinated by the magnesium ion and N117 resulting in a enhanced electrophilicity of the γ-phosphate and a pentavalent intermediate between the γ-phosphate and THZ. Further, the transition state is stabilized by hydrogen bonds of T160 OG to the α-phosphate and of K115 NZ to the β-phosphate.
SaThiM active site with bound THZ (a), cpd 1 (b) and cpd 2 (c). The active site residues are shown in stick representation with carbon chain atoms in the respective chain color, nitrogen in blue, oxygen in red and sulphur in yellow. For THZ carbon atoms are colored in cyan, for cpd 1 in magenta and for cpd 2 in orange. Waters are displayed as red and Mg2+ ions as green spheres. H-bonds are shown as dashed lines. Consensus nomenclature of the substrate THZ and selected lead compounds cpd 1 and cpd 2 are shown, respectively.
In order to identify substrate analogues for SaThiM, a structure-based virtual screening approach was conducted. At first, a focused compound library was generated by searching the ZINC database26 for THZ structure analogues by means of a SMARTS query containing several restrictions: i) a 5-membered heterocyclic ring including a nitrogen atom to enable hydrogen bonding with N39 and excluding a sulfur atom in order to inhibit the carbanion formation for thiamin-dependent enzymes27, and ii) a hydroxy-ethyl moiety in position 4 of the 5-membered ring to allow phosphorylation by the enzyme. Applying these constraints resulted in 78 compounds that were docked into the SaThiM active site using AutoDock 4.2.328 with default settings. Based on docking scores and visual analysis of compound-binding modes, 9 compounds were identified as putative SaThiM substrates. Out of this in silico selected set of molecules, two were chosen as the most promising analogues for further investigations: 2-(1,3,5-Trimethyl-1H-pyrazol-4-yl) ethanol, hereinafter referred to as compound 1 (cpd 1) and 2-(2-Methyl-1H-imidazol-1-yl) ethanol referred to as compound 2 (cpd 2). The activity of ThiM was analyzed in vitro, as described in the methods section, showing that the specific activities of cpd 1 and cpd 2 are approximately 1.5 times higher compared to THZ, however show only 1/10 of the efficiency (kcat/KM) in comparison to the natural substrate THZ (see Table 3 and Supplementary Fig. S6). This is also reflected by the higher KM-value of the compounds.
In summary the kinetic data confirmed that the selected compounds were accepted as substrates, even if in vitro turnover was slightly lower, and could thus be used for further investigations and to optimize effective pro-drug compounds targeting the vitamin B1 biosynthetic pathway. Based on these findings complexes of SaThiM with cpd 1 and cpd 2 were prepared and crystallized.
The structures of these complexes could be refined to 1.87 Å and 1.62 Å resolution with R and Rfree values of 16.86% and 19.90% for the cpd 1 complex and R and Rfree values of 18.24% and 20.28% for the cpd 2 complex. Data collection and refinement parameters are summarized in Table 1 and the coordinates for the structures, as well as the experimental diffraction amplitudes have been deposited at the Protein Databank (http://www.rcsb.org) with entry codes 5CGA and 5CGE. The chemical structure as well as the compounds bound in the active site are shown in Fig. 4b,c, respectively. The overall coordination of the THZ analogue compounds in the active site regions of the ThiM trimer is remarkably comparable to that of the of natural substrate THZ (see Fig. 4a). Both compounds form a H-bond to the amide nitrogen of amino acid M39 and show a similar orientation of their hydroxyethyl groups. The thiazole moiety was replaced by the non-sulfur containing heterocycles pyrazole and imidazole for cpd 1 and cpd 2, respectively. Moreover, cpd 1 contains two additional methyl groups at position 5 and 6 of the heterocycle (see Fig. 4b,c, respectively). These structural differences to the natural substrate result in a 1.5 higher specific activity for both cpd 1 and cpd 2, even if the location of the compounds in the active site is highly comparable to that of the natural substrate, as shown in Table 3, confirming the appropriate pre-positioning for the phosphoryl transfer reaction.
The shortfall in the development of new antibiotics and the misguided overuse of the currently available antibiotics has caused an unfortunate spread of multi-resistant bacteria in recent years. Because of this, rational structure-based drug discovery is urgently required6 to cover the loss by supporting accelerated design of highly selective antibiotics with an elaborated mode of action. To our knowledge this study represents the first approach in targeting the Sa thiazole kinase ThiM of the bacterial vitamin B1 pathway, applying structure based pro-drug discovery. In order to improve crystal quality of SaThiM, we performed crystallization trials under microgravity conditions in combination with micro seeding techniques. This procedure has previously been applied successfully to optimize crystal quality29. We observed an increase in crystal quality compared to native triclinic SaThiM crystals obtained in previous experiments30. Soaking of the respective crystals with ThiM substrate and selected pro-drug compounds resulted in loss of crystal symmetry. Similar observations were made for crystals of the ThiM homologue ThiK from B. subtilis, where soaking with substrates led to crystalline complexes with monoclinic symmetry, in comparison to native rhombohedral crystals19. This effect could be attributed to a slightly changed fold in the loop region 126–140, which changed the interactions and crystal packing of the trimeric subunits in the asymmetric unit. SaThiM revealed a conserved ribokinase-like fold and a trimeric assembly, which was confirmed by complementary SAXS experiments. The three active sites, each located within the interface regions of two monomers respectively, are homologous to other known phosphoryl transfer ribokinase-like kinases25. Based on the overall structural information of ThiM complexes obtained, we propose a catalytic pathway of SaThiM. Further, we identified the role of C190 and the coordinated magnesium ion in enhancing the nucleophilicity of the THZ alcohol and thereby facilitating its phosphorylation via a proton relay mechanism. Structural data of THZ bound in the active sites of SaThiM allowed in silico screening and identification of two initial lead compounds. In terms of the pro-drug development concept, these compounds were used to prepare enzyme-compound complexes. The results of the biochemical assays, complemented by the structural data, support the suggested pathway of phosphorylation. Comparing the specific activities of ThiM in presence of the two compunds revealed a similar turnover as that of the natural substrate THZ, which clearly validates the approach to combine complementary methods for pro-drug discovery in order to identify and improve lead compounds.
The two novel compounds applied for co-crystallization in this study lack the thiazolium sulfur, present in the natural thiazolium moiety of thiamin, which is replaced by a carbon atom, supporting slightly higher flexibility in the active site in consequence of the reduced van der Waals radius. Overall, the orientation of both compounds in the active sites of ThiM is very similar to that observed for the natural substrate THZ.
For both compounds the N3 is retained and a second nitrogen atom at position 2 and 5 is included in the heterocycle of cpd 1 and cpd 2 respectively. Moreover, cpd 1 has two additional methyl groups bound to atoms 1 and 2, which can provide more hydrophobic interactions in binding co-factor dependent enzymes after complexation to the HMP moiety by ThiE thereby enabling the cpd 1-HMP moiety to act as a competitive inhibitor. Cpd 2 has an additional nitrogen atom in the heterocycle and could, like cpd 1, undergo a TPP imino tautomerization after fusion with HMP. As a result this substance could be channeled via thiaminase (TenA) into the bacterial thiamin pool, where it could act as a thiamin antagonist equally potent as pyrithiamine31. The data presented here summarize the first steps towards the development of thiamin analogue compounds, only produced in vivo in bacteria cells, which can inhibit preferably multiple co-factor dependent enzymes and in addition might also block the thiamin riboswitch in the bacteria32. This approach will open a route for the development of new antimicrobial substances to treat MRSA infections.
The expression, purification and initial crystallization of native SaThiM has been described previously30. To optimize the crystal quality and try for a better crystal packing, crystallization experiments under microgravity conditions were performed in the DLR SIMBOX experiment15,33 onboard the Chinese space mission Shenzhou-815. The SIMBOX counter diffusion crystallization experiments were coordinated by the Institute of Biophysics of the Chinese Academy of Sciences, Beijing. For the space experiment, protein solutions were dialyzed overnight against 100 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0. ThiM was concentrated to approximately 20 mg/mL, an equal volume of 0.5 M magnesium formate was added at 4 °C, incubated for at least 6 h and centrifuged at 20,000 × g for 30 min. Prior to the microgravity experiments, crystallization conditions were extensively optimized under laboratory conditions, including transport simulations. The final protein solutions were analyzed by dynamic light scattering and showed a stable monodisperse peak for several days. The capillary length of the SIMBOX crystallization hardware was 10 mm with an inner diameter of 1 mm. The capillary was filled with a ThiM solution using a concentration of 12 mg/mL and 2% (w/v) low melting point agarose (Serva) was used to seal the capillaries. Subsequently, the capillaries were inserted carefully into a plastic casing, containing four separated sections filled with foam material and sealed with a metal lid. The foam was saturated with approximately 300 μL of precipitant solution (20% PEG 3,350 (w/v), 7% isopropanol (v/v)). For the microgravity experiment 4 capillaries were used and positioned in the DLR SIMBOX. The microgravity experiment was performed at a stable temperature of 20 °C for 17 days (30.10.2011–17.11.2011) onboard the Shenzhou-8 space mission. After return of the experiment the capillaries were inspected directly after arrival in Beijing. The capillaries were opened at one end and the agarose was removed carefully. Obtained micro-crystals were used to prepare native ThiM and complex crystals applying hanging drop vapor diffusion and a streak seeding procedure34. Seed stocks were prepared following the manufacturer’s instructions (Jena BioScience Beads-for-seeds). 24-well CPL-130 plates (Jena Bioscience) for hanging drop vapor diffusion experiments were filled with 500 μl of precipitant solution and ThiM was used at a concentration of 10 mg/mL. In 48-well MRC sitting drop plates (Molecular Dimensions) for sitting drop vapor diffusion, two rows of the precipitants with different PEG 3,350 concentrations were prepared by filling 50 μl of precipitant (18, 20 and 22% PEG 3,350 (w/v), 0.2 M magnesium formate and 5% isopropanol (v/v)) into the reservoirs. Purified ThiM was dialyzed overnight against 50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl and directly used at 10 mg/mL concentration after centrifugation (100,000 × g, 4 °C for 50 min). To obtain a ThiM-THZ complex native crystals were supplemented with THZ at a concentration of 0.5 mM overnight. To obtain ThiM-cpd 1 and ThiM-cpd 2 complexes, crystals were soaked with a 25 mM and 20 mM compound 1 und 2 solutions respectively overnight. Prior to data collection crystals were soaked in precipitant solution containing 10% v/v glycerol as cryoprotectant and THZ, cpd 1 or cpd 2 respectively.
Diffraction data of native ThiM were collected as described before30. A complex crystal of ThiM-THZ was used to collected diffraction data using a MARCCD165 detector at the DORIS consortium beamline X13 (HASYLAB/DESY) using a wavelength of 0.81 Å at 100 K. Diffraction data of ThiM-cpd 1 and ThiM-cpd 2 crystals were collected at the EMBL beamline P14 (PETRAIII, DESY, Hamburg) at 0.98 Å wavelength and 100 K with a PILATUS 6M detector.
Data processing and scaling of native ThiM and ThiM-THZ were carried out using DENZO and SCALEPACK35, ThiM-cpd 1 and ThiM-cpd 2 data sets were processed applying the program XDS36. The uncomplexed crystals belonged to the space group P21 (Unit cell parameters: a = 62.6 Å, b = 103.5 Å, c = 126.2 Å and β = 99.5°) with six ThiM molecules, forming 2 trimers, in the asymmetric unit. The packing parameter VM was calculated to be 2.3 Å3/Da37, which corresponded to a solvent content of 47%. Native ThiM crystals, which were grown applying microgravity grown seed stock crystals, were in the monoclinic space group P21. Soaked THZ, cpd 1 and cpd 2 complex crystals are assigned to the triclinic space group P1, due to slightly changed crystal contacts of the six ThiM molecules in the unit cell. Unit cell parameters and data collection and scaling statistics are summarized in Table 1. The coordinates of Bacillus subtilis ThiK (PDB code: 1C3Q) were used as a starting model for molecular replacement applying the program PHASER38 within the CCP4 suite39. The refined native ThiM structure was subsequently used as a starting model for the complex structures, ThiM-THZ, ThiM-cpd 1 and ThiM-cpd 2 applying MOLREP40. The models were refined through iterative cycles of restrained refinement by REFMAC541 and phenix.refine42 and manual rebuilding applying the program COOT43.
Resolution limits of the diffraction data were set applying the criteria I/σ > 2, monitoring Rmerge with a limit of approximately 50%. These criteria resulted in resolution limits of 2.1 Å of the native diffraction data set, 1.9 Å for the THZ complex, 1.85 Å for the cpd 1 and 1.6 Å for the cpd 2 complex. After first manual model building and refinement solvent molecules were included applying Fo-Fc difference maps. For the complex crystals the THZ, cpd 1 and cpd 2 moieties were introduced and refined. Optimized geometry restraints for bond distance and angles of THZ as well as for cpd 1 and cpd 2 were generated with Phenix eLBOW42 and applied for refinement. Magnesium ions, if present, were positioned applying Fo-Fc density maps contoured at 2.5 σ in a tetragonal coordination with ligand residues L115, E120 and D88.
For native ThiM 98% of residues are in the favoured, 2% are in the additional allowed regions of the Ramachandran plot and no residue was found in the disallowed regions. For ThiM-THZ, ThiM-cpd 1 and ThiM-cpd 2 99% are in the favoured regions and 1% is in the additional allowed regions of the Ramachandran plot and no residue was found in the disallowed regions. Analysis was done with MolProbity44.
SAXS data of native ThiM were collected at the EMBL beamline X33 (DORIS III, DESY, Hamburg)45. Using a 1M-W PILATUS detector at a sample-to-detector distance of 2.7 m and a wavelength of λ = 1.5 Å, the range of momentum transfer 0.01 < s < 0.6 Å-1 was covered (s = 4π sinθ/λ, where 2θ is the scattering angle). Four solute concentrations ranging between 1.3 and 9.9 mg/ml were measured at 12 °C. To monitor for the radiation damage, eight successive 15-second exposures of protein solutions were compared and no statistically significant changes were detected. The data were normalized to the intensity of the transmitted beam and radially averaged; the scattering of the buffer was subtracted and the difference curves were scaled for protein concentration. The low angle data measured at lower protein concentrations were merged with the higher concentration data to yield the final composite scattering curves. The radius of gyration Rg, the Porod volume of the hydrated particle along with the distance distribution function p(r) and the maximum intra-molecular distance Dmax were derived using the automated SAXS data analysis pipeline SASFLOW46. The molecular mass (MM) was obtained from the Porod volume: for globular proteins Porod volumes in Å3 are about 1.6 times the MMs in Da. Ab initio shape model was reconstructed using the bead modelling program DAMMIF45. This program represents the particle shape by an assembly of densely packed beads and employs simulated annealing to construct a compact interconnected model fitting the experimental data. A molecular mass estimate is derived from the volume of the model. Ten DAMMIF runs were performed to check the stability of solution, and the results were well superimposable with each other. 15 C-terminal residues missing from the high-resolution X-ray structure were reconstructed with the rigid body modelling program CORAL23, the fit to the experimental data was refined with CRYSOL46. All SAXS-derived parameters are summarized in Table 2, the scattering data and the models are deposited in SASBDB22, code: SASDAX8.
SaThiM activity assays were performed in 100 μl buffer solution containing 50 mM potassium phosphate (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 4 mM ATP (supplied by Sigma), 50 nCi ATP-[P33] and 0–4 mM THZ. 315 ng of purified protein was added and incubated for 15 min at 37 °C. Reactions were quenched at 95 °C for 2 minutes and reaction products were analyzed as described before12. De novo synthesized THZ-[P33] was quantified using a LS5000 CE scintillation detector (BeckmanCoulter). The kinetic parameters were calculated using the GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software) as described previously47 and summarized including the standard deviation in Table 3 and as Supplementary Fig. S6.
Accession codes: PDB: 5CM5 (native), 5COJ (THZ complex), 5CGA (cpd 1 complex) and 5CGE (cpd 2 complex); SASBDB23 code: SASDAX8. http://www.nature.com/srep
How to cite this article: Drebes, J. et al. Structure of ThiM from Vitamin B1 biosynthetic pathway of Staphylococcus aureus – Insights into a novel pro-drug approach addressing MRSA-infections. Sci. Rep. 6, 22871; doi: 10.1038/srep22871 (2016).
Lowy, F. D. Staphylococcus aureus infections. N. Engl. J. Med. 339, 520–32 (1998).
Lowy, F. D. Antimicrobial resistance: The example of Staphylococcus aureus. J. Clin. Invest. 111, 1265–1273 (2003).
Otto, M. Basis of virulence in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Annu. Rev. Microbiol. 64, 143–62 (2010).
Wenzel, R. P. The antibiotic pipeline–challenges, costs, and values. N. Engl. J. Med. 351, 523–6 (2004).
Silver, L. L. Challenges of antibacterial discovery. Clin. Microbiol. Rev. 24, 71–109 (2011).داروی vitamin b1
Secretariat of the WHO. Draft global action plan on antimicrobial resistance – Report by the Secretariat. Sixty-seventh world health assembly, A67/39, Add.1, 1–3 (08 May 2014). http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/WHA67/A67_39Add1-en.pdf.
Müller, I. B. et al. The vitamin B1 metabolism of Staphylococcus aureus is controlled at enzymatic and transcriptional levels. PLoS One 4, e7656 (2009).
Begum, A. et al. Staphylococcus aureus thiaminase II: oligomerization warrants proteolytic protection against serine proteases. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69, 2320–9 (2013).
Breslow, R. On the Mechanism of Thiamine Action. IV. 1 Evidence from Studies on Model Systems. J. Am. Chem. Soc. 80, 3719–3726 (1958).
Laskowski, R. A. et al. PDBsum: a Web-based database of summaries and analyses of all PDB structures. Trends Biochem. Sci. 22, 488–90 (1997).
Petoukhov, M. V. et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 45, 342–350 (2012).
Morris, G. M. et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J. Comput. Chem. 30, 2785–91 (2009).
McPherson, A. Effects of a microgravity environment on the crystallization of biological macromolecules. Microgravity Sci. Technol. 6, 101–9 (1993).
Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 125–32 (2010).
McCoy, A. J. et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658–674 (2007).
Project, C. C. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50, 760–3 (1994).
Murshudov, G. N. et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 67, 355–67 (2011).
Adams, P. D. et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 213–21 (2010).
Chen, V. B. et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 66, 12–21 (2010).
Wrenger, C. et al. Vitamin B1 de novo synthesis in the human malaria parasite Plasmodium falciparum depends on external provision of 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine. Biol. Chem. 387, 41–51 (2006).
Blanchet, C. E. et al. Versatile sample environments and automation for biological solution X-ray scattering experiments at the P12 beamline (PETRA III, DESY). J. Appl. Crystallogr. 48, 431–443 (2015).
Download references
This work was supported by the DLR via grant 50WB1017, by the DFG Excellence Cluster CUI (Centre for Ultra Fast Imaging) and via grant WR124/2, BMBF (01DN13037), the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 2013/10288-1), by the Hamburg Ministry of Science and Research and Joachim Herz Stiftung as part of the Hamburg Initiative for Excellence in Research, the Hamburg School for Structure and Dynamics in Infection (SDI). Additionally this work was supported by the University of Hamburg (UHH)/University of Sao Paulo (USP) co-funding scheme CG 83.353. Further we would like to thank Benjamin Dose, Robin Schubert, Yong Yu and Jun Liu.
Present address: Multiuser Center for Biomolecular Innovation, Department of Physics, Universidade Estadual Paulista (UNESP), São Jose do Rio Preto-SP 15054-000, Brazil.
Present address: Center for Free-Electron Laser Science, Deutsches Elektronen Synchrotron-DESY, Notkestrasse 85, 22607 Hamburg, Germany.
These authors contributed equally to this work.
J.D. conducted biochemical experiments, crystallization and diffraction data collection of native ThiM and ThiM-THZ. M.K. optimized ThiM purification, conducted crystallization, diffraction data collection and structure analysis of cpd 1 and cpd 2 complex structures. R.J.E. and D.O. prepared microgravity crystallization experiments. Kinetic assays were performed by J.D., I.B.M. and B.W. performed in silico work. J.D. and A.K. conducted the SAXS experiments, A.K. and D.S. analyzed the SAXS data. H.C. facilitated the Shenzhou microgravity experiments. J.D., M.K., M.P., C.W. and C.B. designed the overall study and wrote the manuscript.
The authors declare no competing financial interests.
Correspondence to Christian Betzel or Carsten Wrenger.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license, unless indicated otherwise in the credit line; if the material is not included under the Creative Commons license, users will need to obtain permission from the license holder to reproduce the material. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
19 October 2015
03 February 2016
10 March 2016
https://doi.org/10.1038/srep22871
Future Medicinal Chemistry
(2016)
By submitting a comment you agree to abide by our Terms and Community Guidelines. If you find something abusive or that does not comply with our terms or guidelines please flag it as inappropriate.
4 Citations
17 Altmetric
Article metrics
Advanced search
ISSN 2045-2322 (online)
© 2019 Springer Nature Publishing AG
